04714naa a2200289 a 450000100080000000500110000800800410001902200140006010000150007424503320008926000090042130000230043049000140045352037070046765000110417465000370418565000160422265000310423865000130426965000120428265300090429470000160430370000170431970000140433670000170435077300570436710509032023-06-06       2013    bl uuuu     u00u1 u    #d  a1027-28521 aUMAÑA, R.  aEvaluation of four viroid rna extraction methods for the molecular diagnosis of cevd in citrus lemon using rt-pcr, dot blot and northern blot. [Evaluación de cuatro métodos de extracción de ARN viroide para el diagnóstico molecular de CEVd en Citrus limon mediante RT-PCR, Dot blot y Northern blot.].h[electronic resource]  c2013  c2-s2.0-84884171392  a1027-2852  aABSTRACT. An efficient method for RNA extraction that leads to RNA high yield and purity is a technical issue relevant for development and optimization of molecular diagnostic methods aimed to detect viroid infections in citrus varieties.  Residual contaminants may affect RNA detection depending on the molecular diagnosis approaches. This condition can be evaluated through RNA absorption spectrum analysis. Functionally, it is assessed through observation of RTPCR amplification products and Northern blot and Dot-blot signal intensities, displaying levels of analytical response/ sensitivity. Four RNA extraction methods were evaluated to determine their effects on the capacity to detect viroid CEVd presence/absence in Citrus limon through four molecular diagnostic approaches: 1) conventional viroid extraction (CVE); 2) phenol/guanidine thiocyanate (PGT), 3) SDS/potassium acetate (SPA); and 4) formaldehyde/ SSC (FS). Phloem tissue quantifications showed values between 7500 ng/μL and 1200 ng/μL and ranged 1.3-2.0 OD260/280. Evaluations through RT-PCR showed the expected amplifications of the entire CEVd genome, but erratic scenarios still remained. Non-radioactive probe hybridization techniques revealed high intensity signals (132 RU) for infected tissue, by using the CVE method, and a positivity cut-off for the presence of infection was established (78 RU). Nevertheless, molecular hybridization tools can jeopardize the diagnosis due to the thoroughness of the protocol and the RNA template conditions. The diagnostic ability of the association of Northern blot with CVE viroid extraction analyses as starting point was evidenced for successful detection, among the molecular methods tested.  RESUMEN.Evaluación de cuatro métodos de extracción de ARN viroide para el diagnóstico molecular de CEVd en Citrus limon mediante RT-PCR, Dot blot y Northern blot. En el desarrollo de metodologías moleculares diagnósticas en variedades cítricas propensas a infección viroide, se precisa la extracción efi ciente de ARN, siguiendo criterios de concentración y pureza. Los contaminantes remanentes pueden afectar la detección según la herramienta molecular escogida. Esta condición se analiza a partir del espectro de absorción del ARN; mediante la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR) y por los niveles de intensidad de las señales de Northern blot y Dot blot, en términos de respuesta analítica/sensibilidad. Se evaluaron cuatro métodos de extracción de ARN, por sus efectos sobre la detección de presencia/ausencia del Citrus Exocortis Viroid (CEVd) en Citrus limon mediante análisis moleculares diagnósticos: 1) extracción viroide convencional (EVC); 2) fenol/tiocianato de guanidina (FTG); 3) SDS/ acetato de potasio (SAP); y 4) formaldehído/SSC (FS). Los valores del tejido de fl oema estuvieron entre 7500 ng/μL y 1200 ng/μL y los rangos entre 1.3 y 2.0 DO260/280. La evaluación por aproximaciones de la RT-PCR reflejó las amplifi caciones esperadas del genoma completo del CEVd; sin embargo, aún se discuten los escenarios erráticos. Las hibridaciones no radiactivas revelaron señales de alta intensidad (132 UR) para el tejido infectado, según el método de EVC, y la defi nición del límite de positividad para la presencia de infección (78 UR). Las herramientas basadas en hibridaciones moleculares interfi eren en el diagnóstico, por la rigurosidad del protocolo y las condiciones del ARN molde. La extracción viroide como punto de partida de una detección exitosa y los métodos moleculares ensayados, mostraron las posibilidades diagnósticas de la asociación de Northern blot con la EVC.  aCITRUS  aDETECCIÓN DE VIROIDES DE CITRUS  aDIAGNOSTICO  aENFERMEDADES DE LOS CITRUS  aTECNICAS  aVIROSIS  aCEVd1 aPRITSCH, C.1 aARBIZA, J.R.1 aRIVAS, F.1 aPAGLIANO, G.  tBiotecnologia Aplicada, 2013gv.30, no.2, p.125-130.